西亞試劑：三色書虱體內(nèi)wolbachia的分子檢測

三色書虱采自野外，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立種群。

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1. 三色書虱總DNA的制備

   (1) 將50頭書虱置于1.5mL的離心管中，用研棒在液氮環(huán)境中迅速將試蟲充分研碎后加入200µL DNA提取裂解液。

   (2) 加入2.5µL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，50℃水浴2h(或培養(yǎng)過夜)。

   (3) 用等體積的平衡酚( Tris-HC1飽和酚，pH7.8 )，溫和振蕩搖勻(約20 min )，置20℃下保存5-10 min。

   (4) 4℃下離心l0min，將粘稠的水相移至潔凈的離心管中。

   (5) 用等體積的酚:氯仿(1:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提取一次，離心(9000 r/min 10 min)取上清液。

   (6) 加入0.2倍體積的乙酸鈉溶液(10 mol/L)和兩倍體積的無水乙醇，-20℃放置2h使DNA充分沉淀。

   (7) 離心(12000 r/min 10 min )，棄上清液，沉淀用70%乙醇(4℃)洗滌兩次。

   (8) 沉淀晾干(盡可能除去乙醇)后，將DNA重懸浮于TE緩沖液(pH8.0 )，于37℃中輕輕搖動有利于DNA重懸浮，使DNA充分溶解。

   (9) 加入Rnase至終濃度為lµg/mL，37℃保溫lhr。

   (10) 按(4)~(9)抽提，沉淀，重懸DNA，在1µL雙蒸滅菌水或TE中，4℃保存。

   (11) 取DNA4µL與2µ1 6x加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣到1.4%瓊脂糖凝膠中，以2.5-5 v/cm電泳。

   (12)  0.5µg/mL的EB染色15-30min，紫外燈下觀察拍照。

制備的DNA濃度用SmartSpec^TM3000核酸濃度分析儀檢測，要求先將比色杯用100µL/次的無菌水反復(fù)清洗再測水的吸光度，之后將DNA液稀釋50倍進(jìn)行檢測。要求OD=1.7左右。

2. 三色書虱體內(nèi)共生細(xì)菌Wolbachia的Long PCR檢測

Long PCR的20uL的反應(yīng)體系包括:

 

10 x buffer	5 µL
25 mM MgCl2	2 µL
10 mM dNTP	0.7 µL
Pwo酶	1 U
Taq DNA	5 U
模板	10 ng
10µM引物	1.6 µL

wsp-F, 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AAG AAA CTA GCT A

wsp-R, 5'-AAAAAT TAAACG CTA CTC CAG CTT CTG CAC

用無菌水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20µL

擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2min預(yù)變性后，94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin，10個循環(huán)；94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin。25個循環(huán)，每個循環(huán)在68℃下延長20sec。

擴(kuò)增結(jié)束后取5µL的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(電壓5v/cm，電泳緩沖液為1 X TAE )，Bio-Rad凝膠成象系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

3. 序列的測定和分析

Wolbachia wsp基因序列由Long PCR產(chǎn)物上海生工直接測序獲得。DNA序列檢索和同源性比較利用BLAST工具(NCBI網(wǎng)站)。用程序中的最大似然法(Maximum Likelihood method，ML)重建系統(tǒng)發(fā)生樹，系統(tǒng)發(fā)生樹中結(jié)點(diǎn)的自舉檢驗(yàn)置信度以1000次重復(fù)計(jì)算估計(jì)。對獲得的三色書虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因的片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其它一些宿主體內(nèi)的Wolbachia的wsp基因的片段則通過GenBank獲得。

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